Anticuerpos policlonales contra la proteína recombinante NS3 del virus del dengue / Polyclonal antibodies against recombinant dengue virus NS3 protein

Resumen Introducción: El dengue es una enfermedad causada por uno de los cuatro serotipos del virus del dengue (DENV) y es endémica en, aproximadamente, 130 países. Su incidencia ha aumentado notablemente en las últimas décadas, así como la frecuencia y la magnitud de los brotes. A pesar de los esfuerzos, no existen tratamientos profilácticos ni terapéuticos contra la enfermedad y, en ese contexto, el estudio de los procesos que gobiernan el ciclo de infección del DENV es esencial para desarrollar vacunas o terapias antivirales. Una de las moléculas del DENV más prometedoras es la proteína no estructural 3 (NS3), la cual es indispensable para la replicación viral y es uno de los principales blancos inmunológicos durante la infección. Objetivo: Producir anticuerpos policlonales para contribuir a los futuros estudios sobre las interacciones entre la proteína NS3 y otras proteínas celulares. Materiales y métodos: Se expresaron dos proteínas recombinantes del dominio helicasa de NS3 del DENV de serotipo 2, las cuales se emplearon para inmunizar ratas y producir anticuerpos policlonales. Resultados: Los anticuerpos producidos fueron útiles en ensayos de Western blot e inmunofluorescencia y se reportó por primera vez un anticuerpo policlonal anti-NS3 que permitió la inmunoprecipitación de la proteína viral y la detecta con Western blot sin necesidad de inducir sobreexpresión de NS3 o de usar extractos de células marcados metabólicamente con radioisótopos. Conclusión: Las proteínas recombinantes expresadas y los anticuerpos producidos constituyen herramientas valiosas para estudiar procesos infecciosos del DENV que involucren a la proteína NS3 y evaluar pruebas dirigidas a interferir las funciones de esta proteína.

Abstract Introduction: Dengue is a disease caused by one of four serotypes of the dengue virus (DENV) and is endemic in approximately 130 countries. The incidence of dengue has increased dramatically in recent decades, as well as the frequency and magnitude of outbreaks. Despite all efforts, there are no prophylactic or therapeutic treatments for the disease. Accordingly, research on the processes governing the DENV infection cycle is essential to develop vaccines or antiviral therapies. One of the most attractive DENV molecules to investigate is nonstructural protein 3 (NS3), which is essential for viral replication and a major immune target for infection. Objective: To produce antibodies to support future studies on NS3 and its cellular interactions with other proteins. Materials and methods: Two recombinant proteins of the helicase domain of DENV NS3 serotype 2 were expressed, and used to immunize mice and produce polyclonal antibodies. Results: The antibodies produced were useful in Western blot and immunofluorescence tests. We report an NS3 antibody that immunoprecipitates the viral protein and detects it in Western blot with no need to over-express it or use cell extracts with metabolic radiolabeling.

Muerte celular programada en protozoarios: el caso de Giardia intestinalis / Programmed cell death in protozoa: Giardia intestinalis’s case

Giardia intestinalis es considerado uno de los eucariotas más antiguos y su poca complejidad representa una valiosa oportunidad para desentrañar los misterios de procesos vitales de eucariotas más complejos. Esta característica única de G. intestinalis y el hecho de que su genoma esté completamente secuenciado y disponible, y que todo su ciclo de vida puede ser reproducido in vitro, hacen de este parásito un modelo ideal para estudiar mecanismos celulares, entre ellos, la muerte celular programada. Desde el punto de vista morfológico y molecular, la apoptosis es uno de los tipos más complejos de muerte celular programada, la cual es un proceso normal durante el desarrollo celular, y tiene un papel esencial en el control de la proliferación celular y en la respuesta a retos inmunológicos o a daños celulares. Recientemente, se ha reportado que en protozoos, entre ellos Giardia, podría ocurrir un tipo de muerte celular programada similar a la apoptosis y los resultados de nuestros laboratorios apoyan esta hipótesis; sin embargo, no se han identificado hasta el momento las moléculas relacionadas con los procesos de apoptosis en estos parásitos. La presente revisión abarca una descripción de la morfología y estructura de las formas de vida de G. intestinalis, de su ciclo biológico, de la parasitosis que causa y de las estrategias quimioterapéuticas para su tratamiento. Asimismo, se hace un repaso de lo que hasta ahora se conoce sobre apoptosis en protozoarios, y específicamente en G. intestinalis, y se describen algunos resultados de nuestro grupo que apoyan la existencia de muerte celular programada en este parásito.

Giardia intestinalis is an early-branching eukaryote and its low complexity represents a valuable opportunity to unravel the mysteries of essential processes in more complex eukaryotes. In addition, the genome of G. intestinalis is completely sequenced and its entire life cycle can be reproduced in vitro. All these characteristics make of Giardia an ideal model for studying cellular mechanisms, such as programmed cell death. Apoptosis is one of the most complex types of programmed cell death and plays an essential role during cell development, cell proliferation and immune response. Recently it has been reported that in Giardia can take place events that resemble apoptosis and although our results support this hypothesis, molecules involved in this process have not yet been identified. This review includes a description of the morphology and structure of G. intestinalis, its life cycle, the disease that causes and the strategies for its treatment. In addition, we review what is known about apoptosis in protozoa, and specifically in G. intestinalis, and describe some results from our group supporting the existence of apoptosis-like programmed cell death in this parasite.

Virus del dengue: estructura y ciclo viral / Dengue virus: structure and viral cycle

El virus del dengue (DENV) es el agente causal de la enfermedad conocida como dengue, que es la principal enfermedad viral transmitida por artrópodos en el mundo. El DENV es un flavivirus que ingresa por endocitosis y se replica en el citoplasma de la célula infectada, originando tres proteínas estructurales y siete proteínas no estructurales, sobre las cuales se conocen sólo algunas de sus funciones en la replicación viral o en la infección. El ciclo viral que ocurre en las células infectadas hasta ahora está comenzando a aclararse y su conocimiento permitirá en el futuro próximo diseñar racionalmente moléculas que lo intervengan y eviten la replicación del virus. Durante la infección, el individuo puede presentar fiebre indiferenciada o, en otros casos, puede presentar un proceso generalizado de activación de la respuesta inmunitaria innata y adquirida, lo cual provoca la liberación de factores inflamatorios solubles que alteran la fisiología de los tejidos, principalmente el endotelio, conllevando al desarrollo de manifestaciones clínicas graves. Aunque se ha identificado un gran número de factores del individuo asociados al desarrollo de la enfermedad por DENV, queda por identificar el papel de las diferentes proteínas virales en la patogenia de la enfermedad. En la presente revisión, se presenta una breve actualización sobre la estructura y biología del DENV, de su ciclo viral intracelular y, finalmente, se introducen algunos conceptos sobre la inmunopatogenia de la enfermedad producida por este agente.

Dengue virus (DENV) is responsible for the clinical entity known as dengue that is a great concern for economy and public health of tropical countries. This flavivirus is a single strand RNA virus that after their translation and replication in host cells produces three structural and seven non-structural proteins with specific function in replication or cell binding process that we will describe here. Intracellular viral cycle has begun to be described and this knowledge will impact the rational design of new antiviral drugs. Patients suffering dengue can have an undifferentiated fever or in the severe cases, show an aberrant immunological activation process that lead to soluble inflammatory mediators secretion, affecting tissue function, mainly endothelium. This organ dysfunction is associated with plasma leakage and coagulatory imbalance. Despite it has been recently described some host factors associated with severity of infection, it remains unknown some aspects of viral biology or the role of DENV proteins in disease pathogenesis. This article pretends to make an updated revision about DENV structure, cell viral cycle and introduce some concepts about dengue immunopathogenesis.

Ultrastructural description of rabies virus infection in cultured sensory neurons

Primary cultures were made from adult mouse spinal ganglia for depicting an ultrastructural description of rabies virus (RABV) infection in adult mouse sensory neuron cultures; they were infected with rabies virus for 24, 36, and 48 h. The monolayers were processed for transmission electron microscopy and immunochemistry studies at the end of each period. As previously reported, sensory neurons showed great susceptibility to infection by RABV; however, in none of the periods evaluated were assembled virions observed in the cytoplasm or seen to be associated with the cytoplasmic membrane. Instead, fibril matrices of aggregated ribonucleoprotein were detected in the cytoplasm. When infected culture lysate were inoculated into normal animals via intra-cerebral route it was observed that these animals developed clinical symptoms characteristic of infection and transmission electron microscopy revealed assembled virions in the cerebral cortex and other areas of the brain. Sensory neurons infected in vitro by RABV produced a large amount of unassembled viral ribonucleoprotein. However, this intracellular material was able to produce infection and virions on being intra-cerebrally inoculated. It can thus be suggested that the lack of intracellular assembly in sensory neurons forms part of an efficient dissemination strategy.

Comparación de tres técnicas de trazado retrógrado para la identificación del origen espinal del nervio ciático en ratón / Comparison of three neurotracing techniques for identification of the sciatic nerve spinal origen in mice

En el presente trabajo se compararon tres técnicas para la aplicación de dos tipos de trazadores retrógrados fluorescentes (Dil y Fluorogold), con el fin de identificar las neuronas motoras y sensoriales que contribuyen con fibras al nervio ciático en ratones adultos. Se ensayó la aplicación de cristales directamente en el nervio, la inyección intraneural y la impregnación del nervio seccionado usando una cámara de silicona. La localización específica de las neuronas motoras en la médula espinal y las neuronas sensoriales en los ganglios de la raíz dorsal que aportan al nervio ciático de ratón se logró aplicando el Fluorogold mediante una cámara en el cabo proximal de los nervios previamente seccionados. Al utilizar el trazador Dil, la misma técnica no permitió hacer la identificación específica de las neuronas. Se encontró que al nervio ciático de ratón podrían contribuir el ganglio de la raíz dorsal más rostrales que los informados para ratas. Estos resultados muestran que la metodología de aplicación de neurotrazadores en cápsula y la descalcificación de tejidos es útil para la localización de neuronas de ganglios de raíz dorsal y de la médula espinal que componen el nervio ciático de ratón adulto, lo que en el futuro permitir obtener mayor información sobre la neuroanatomía básica del ratón.

ATPasa de calcio en el sistema nervioso / Calcium ATPase in the nervous system

La bomba de calcio es una proteína integral de la membrana que regula el calcio libre citoplasmático en concentraciones menores de 0,1 mM. En la mayoría de las células eucarióticas está ubicada en la membrana, en el plasmalema o en organelos como el retículo sarcoendoplásmico y los calciosomas. Su actividad está dada por la hidrólisis de ATP, la concentración del ion en el citoplasma y por otros factores que regulan como la calmodulina, los fosfolípidos y las proteínas - cinasas. Por diferentes métodos, se ha detectado la ATPasa de calcio y su actividad en el tejido nervioso central y periférico, como en otros tejidos